Sleutelverskil – Noordelike vs Suidelike vs Westelike Blotting
Opsporing van spesifieke volgordes van DNA, RNA en proteïene is noodsaaklik vir verskeie tipes studies in molekulêre biologie. Gelelektroforese is 'n tegniek wat DNA, RNA en proteïene volgens hul groottes skei. Uit die jelprofiele word spesifieke DNS-volgorde, RNA-volgorde of proteïen opgespoor deur die spesiale tegnieke wat blotting en hibridisasie met gemerkte probes genoem word. Daar is drie verskillende tipes kladmetodes, naamlik suidelike, noordelike en westelike. Die belangrikste verskil tussen noordelike suidelike en westelike klad lê by die tipe molekule wat dit van 'n monster opspoor. Southern blotting is 'n metode wat 'n spesifieke DNS-volgorde van 'n DNS-monster opspoor. Northern blotting is 'n tegniek wat 'n spesifieke RNA-volgorde van 'n RNA-monster opspoor. Western blotting is 'n metode wat 'n spesifieke proteïen van 'n proteïenmonster opspoor.
Wat is Southern Blotting?
Southern kladtegniek is in 1975 deur E. M. Southern ontwikkel vir die identifikasie van 'n spesifieke DNS-volgorde vanaf 'n DNS-monster. Dit is die eerste kladtegniek wat in molekulêre biologie bekendgestel is. Dit het die opsporing van spesifieke gene van die DNA, spesifieke fragmente van DNA, ens moontlik gemaak. Daar is verskeie stappe betrokke by suidelike kladtegniek. Hulle is soos volg.
- DNA word uit die monster geïsoleer en verteer met beperking-endonukleases.
- Verteerde monster word geskei deur Agarose-gelelektroforese.
- DNA-fragmente in die jel word in enkelstringe gedenatureer deur die gebruik van 'n alkaliese oplossing.
- Enkelstring-DNS word na 'n nitrosellulose-filtermembraan oorgedra deur kapillêre oordrag.
- Oorgedra DNA word permanent op die membraan vasgemaak.
- Vaste DNA op die membraan word gehibridiseer met gemerkte probes.
- Ongebonde DNA word van die membraan afgewas deur te was.
- X-straalfilm word aan die membraan blootgestel en 'n outoradiograaf word voorberei.
Southern blotting word vir verskillende aspekte van molekulêre biologie toegepas. Dit is nuttig in RFLP-kartering, forensiese studies, DNA-metilering in geenuitdrukking, opsporing van gemuteerde gene in genetiese afwykings, DNA-vingerafdrukke, ens.
Figuur 01: Southern Blotting-tegniek
Wat is Northern Blotting?
Northern blotting is 'n metode wat ontwerp is om 'n spesifieke RNA-volgorde of mRNA-volgorde van 'n monster op te spoor om geenuitdrukking te bestudeer. Hierdie tegniek is ontwikkel deur Alwine, Kemp en Stark in 1979. Dit verskil van die suidelike en westelike kladtegnieke as gevolg van verskeie stappe. Hierdie tegniek word egter ook uitgevoer via gelelektroforese, klad en hibridisasie met spesifieke gemerkte probes en opsporing. Noordelike kladtegniek word soos volg uitgevoer.
- RNA word uit die monster onttrek en deur gelelektroforese geskei.
- RNA word van die jel na 'n kladmembraan oorgedra en vasgemaak.
- Die membraan word behandel met 'n gemerkte sonde wat van cDNA of RNA voorberei is (die sonde is komplementêr tot 'n spesifieke volgorde in die monster).
- Die sonde word met die membraan geïnkubeer om met 'n spesifieke volgorde te bind.
- Ongebonde sondes word afgewas.
- Verbasterde fragmente word deur 'n outoradiograaf opgespoor.
Noordelike klad is 'n belangrike hulpmiddel in die opsporing en kwantifisering van gehybridiseerde mRNA, bestudering van RNA-afbraak, evaluering van RNA-halfleeftyd, opsporing van RNA-splyting, bestudering van geenuitdrukking, ens.
Figuur 02: Northern Blotting
Wat is Western Blotting?
Western blotting is 'n metode om 'n spesifieke proteïen uit 'n proteïenmengsel op te spoor deur die gebruik van gemerkte teenliggaampies. Daarom staan westelike klad ook bekend as 'n immunoblot. Hierdie tegniek is in 1979 deur Towbin et al ingestel en dit word nou gereeld in die laboratoriums vir proteïenanalise uitgevoer. Stappe is soos volg.
- Proteïene word uit die monster onttrek
- Proteïene word geskei deur hul groottes met behulp van poliakrielamiedgelelektroforese
- Geskeide molekules word deur elektroporasie na 'n PVDF-membraan of nitrosellulose-membraan oorgedra
- Die membraan is geblokkeer vir nie-spesifieke binding met die teenliggaampies
- Oorgedra proteïene word met primêre teenliggaampies (ensiem-gemerkte teenliggaampies) gebind.
- Die membraan word gewas om nie-spesifiek gebonde primêre teenliggaampies te verwyder
- Gebonde teenliggaampies word opgespoor deur 'n substraat by te voeg en die gekleurde neerslag wat gevorm word op te spoor
Western klad is nuttig in die opsporing van teen-MIV-teenliggaampies in 'n menslike serummonster. Western klad kan ook gebruik word as 'n bevestigende toets vir Hepatitis B-infeksie en definitiewe toets vir malbeessiekte.
Figuur 03: Western Blotting
Wat is die verskil tussen Northern Southern en Western Blotting?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| tipe molekule bespeur | |
| Northern Blotting | Northern blotting bespeur 'n spesifieke RNA-volgorde van 'n RNA-monster. |
| Southern Blotting | Southern blotting bespeur 'n spesifieke DNS-volgorde vanaf 'n DNS-monster. |
| Western Blotting | Western klad bespeur 'n spesifieke proteïen uit 'n proteïenmonster. |
| Tipe gel | |
| Northern Blotting | Dit gebruik agarose/formaldehiedgel. |
| Southern Blotting | Dit gebruik 'n Agarose-gel. |
| Western Blotting | Dit gebruik Polyacrylamide-gel. |
| Blotmetode | |
| Northern Blotting | Dit is 'n kapillêre oordrag. |
| Southern Blotting | Dit is 'n kapillêre oordrag. |
| Western Blotting | Dit is 'n elektriese oordrag. |
| Probes gebruik | |
| Northern Blotting | cDNA- of RNA-probes wat radioaktief of nie-radioaktief gemerk is. |
| Southern Blotting | DNA-probes word radioaktief of nie-radioaktief gemerk. |
| Western Blotting | Primêre teenliggaampies word as probes gebruik. |
| Opsporingstelsel | |
| Northern Blotting | Dit word gedoen deur gebruik te maak van 'n outoradiograaf, of opsporing van lig of kleurverandering. |
| Southern Blotting | Dit word gedoen met behulp van 'n outoradiograaf, opsporing van lig of kleurverandering. |
| Western Blotting | Dit word gedoen deur die opsporing van lig of kleurverandering te gebruik. |
Opsomming – Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting is 'n spesiale tegniek wat ontwikkel is vir die identifikasie van spesifieke DNA, RNA of proteïen uit die monsters. Daar is drie afsonderlike kladprosedures, naamlik noordelike, suidelike en westelike, om 'n spesifieke tipe molekule op te spoor. Northern kladtegniek is ontwerp om 'n spesifieke RNA-volgorde van 'n mengsel van RNA op te spoor. Southern blotting-tegniek maak die opsporing van 'n spesifieke DNS-volgorde van 'n DNS-monster moontlik en westerse kladtegniek word ontwikkel om 'n spesifieke proteïen uit 'n proteïenmengsel te identifiseer.
