Sleutelverskil – Mikroskikking vs RNA-volgordebepaling
Transkriptoom verteenwoordig die hele inhoud van RNA wat in 'n sel teenwoordig is, insluitend mRNA, rRNA, tRNA, gedegradeerde RNA en nie-gedegradeerde RNA. Die profilering van transkriptoom is 'n belangrike proses om die sel-insigte te verstaan. Daar is verskeie gevorderde metodes vir transkriptoom-profilering. Mikroskikking- en RNA-volgordebepaling is twee tipes tegnologieë wat ontwikkel is om transkriptoom te ontleed. Die sleutelverskil tussen mikroskikking- en RNA-volgordebepaling is dat mikroskikking gebaseer is op die hibridiseringspotensiaal van voorafontwerpte gemerkte probes met teiken-cDNA-volgordes, terwyl RNA-volgordebepaling gebaseer is op die direkte volgordebepaling van cDNA-stringe deur gevorderde volgordebepalingstegnieke soos NGS. Mikroskikking word uitgevoer met die voorkennis oor die volgordes en RNA-volgordebepaling word uitgevoer sonder die voorafkennis oor volgordes.
Wat is Microarray?
Microarray is 'n robuuste, betroubare en hoë deursetmetode wat gebruik word vir transkripsieprofiele deur wetenskaplikes. Dit is die gewildste benadering vir transkripsie-analise. Dit is 'n laekostemetode, wat afhang van die hibridiseringsondersoeke.
Die tegniek begin met onttrekking van mRNA uit die monster en die konstruksie van cDNA-biblioteek uit totale RNA. Dan word dit gemeng met fluoresserend gemerkte vooraf ontwerpte probes op 'n soliede oppervlak (kolmatriks). Komplementêre volgordes hibridiseer met die gemerkte probes in die mikroskikking. Dan word mikroskikking gewas en gekeur, en die beeld word gekwantifiseer. Versamelde data moet ontleed word om die relatiewe uitdrukkingsprofiele te kry.
Daar word aanvaar dat die intensiteit van die mikroskikkingsondersoeke eweredig is aan die hoeveelheid transkripsies in die monster. Die akkuraatheid van die tegniek hang egter af van die ontwerpte probes, voorafkennis van die volgorde en die affiniteit van probes vir hibridisasie. Mikroskikkingstegnologie het dus beperkings. Mikroskikkingstegniek kan nie met lae oorvloed transkripsies uitgevoer word nie. Dit slaag nie daarin om isovorme te onderskei en genetiese variante te identifiseer nie. Aangesien hierdie metode afhanklik is van verbastering van probes, vind sommige probleme wat met hibridisasie verband hou, soos kruis-hibridisering, nie-spesifieke hibridisasie, ens. plaas in mikroskikkingstegniek.
Figuur 01: Mikroskikking
Wat is RNA-volgordebepaling?
RNA-haelgeweer-volgordebepaling (RNA-volgorde) is 'n onlangs ontwikkelde hele transkripsievolgordebepalingstegniek. Dit is 'n vinnige en hoë deursetmetode van transkriptoomprofilering. Dit kwantifiseer die uitdrukking van gene direk en lei tot 'n diepgaande ondersoek van die transkripsie. RNA seq is nie afhanklik van vooraf ontwerpte probes of voorafkennis van die volgordes nie. Daarom het RNA seq metode 'n hoë sensitiwiteit en vermoë om nuwe gene en genetiese variante op te spoor.
RNA-volgordebepalingsmetode word deur verskeie stappe uitgevoer. Totale RNA van die sel moet geïsoleer en gefragmenteer word. Dan, met behulp van omgekeerde transkriptase, moet 'n cDNA-biblioteek voorberei word. Elke cDNA-string moet met adapters geligeer word. Dan moet die geligeerde fragmente geamplifiseer en gesuiwer word. Laastens deur 'n NGS-metode te gebruik, moet volgordebepaling van die cDNA uitgevoer word.
Figuur 02: RNA-volgordebepaling
Wat is die verskil tussen Microarray- en RNA-volgordebepaling?
Microarray vs RNA-volgordebepaling |
|
| Microarray is 'n robuuste, betroubare, hoë deursetmetode. | RNA-volgordebepaling is 'n akkurate en hoë-deurvloeimetode. |
| Koste | |
| Dit is 'n laekoste-metode. | Dit is 'n duur metode. |
| Analise van 'n groot aantal monsters | |
| Dit vergemaklik die ontleding van 'n groot aantal monsters gelyktydig. | Dit vergemaklik die ontleding van 'n groot aantal monsters. |
| Data-analise | |
| Data-analise is kompleks. | Meer data word in hierdie metode gegenereer; dus is die proses meer kompleks. |
| Vorige kennis van reekse | |
| Hierdie metode is gebaseer op hibridiseringsondersoeke, dus voorafkennis van rye word vereis. | Hierdie metode hang nie af van die voorafgaande volgordekennis nie. |
| Struktuurvariasies en nuwe gene | |
| Hierdie metode kan nie strukturele variasies en nuwe gene opspoor nie. | Hierdie metode kan strukturele variasies opspoor soos geensamesmelting, alternatiewe splitsing en nuwe gene. |
| Sensitiwiteit | |
| Dit kan nie verskille in uitdrukking van isovorme bespeur nie, so dit het beperkte sensitiwiteit. | Dit het hoë sensitiwiteit. |
| Uitkoms | |
| Dit kan slegs relatiewe uitdrukkingsvlakke tot gevolg hê. Dit gee nie absolute kwantifisering van geenuitdrukking nie. | Dit gee absolute en relatiewe uitdrukkingsvlakke. |
| Data-heranalise | |
| Dit moet herloop word om weer te ontleed. | Opeenvolgingdata kan herontleed word. |
| Behoefte aan spesifieke personeel en infrastruktuur | |
| Spesifieke infrastruktuur en personeel word nie vir mikroskikking benodig nie. | Spesifieke infrastruktuur en personeel benodig deur RNA-volgordebepaling. |
| Tegniese kwessies | |
| Microarray-tegniek het tegniese probleme soos kruis-hibridisering, nie-spesifieke verbastering, beperkte opsporingstempo van individuele probes, ens. | RNA seq-tegniek vermy tegniese kwessies soos kruishibridisering, nie-spesifieke hibridisasie, beperkte opsporingstempo van individuele probes, ens. |
| Biases | |
| Dit is 'n bevooroordeelde metode aangesien dit van verbastering afhang. | Vooroordeel is laag in vergelyking met mikroskikking. |
Opsomming – Mikroskikking vs RNA-volgordebepaling
Mikroskikking- en RNA-volgordebepalingsmetodes is hoë deursetplatforms wat ontwikkel is vir transkripsieprofielvorming. Beide metodes lewer resultate wat hoogs gekorreleer is met geenuitdrukkingprofiele. RNA-volgordebepaling het egter voordele bo mikroskikking vir geenuitdrukking-analise. RNA-volgordebepaling is 'n meer sensitiewe metode vir die opsporing van lae oorvloed transkripsies as mikroskikking. RNA-volgordebepaling maak ook die differensiasie tussen isovorme en identifikasie van geenvariante moontlik. Mikroskikking is egter die algemene keuse van die meeste navorsers aangesien RNA-volgordebepaling 'n nuwe en duur tegniek is met databergingsuitdagings en komplekse data-analise.
