Sleutelverskil – PCR vs DNA-volgordebepaling
PCR en DNA-volgordebepaling is twee belangrike tegnieke in Molekulêre Biologie. Polimerase kettingreaksie (PCR) is die proses wat 'n groot aantal kopieë van 'n DNA-fragment skep. DNA-volgordebepaling is die tegniek wat lei tot die presiese volgorde van die nukleotiede van 'n gegewe DNA-fragment. Dit is die belangrikste verskil tussen PCR en DNA-volgordebepaling. PCR is een van die belangrikste stappe betrokke by DNA-volgordebepaling.
Wat is PCR?
Polymerase-kettingreaksie (PCR) is 'n DNA-amplifikasietegniek wat in Molekulêre Biologie gebruik word. Dit produseer duisende tot miljoene kopieë van 'n spesifieke DNS-fragment. Hierdie metode is ontwikkel deur Kary Mullis in 1983. In hierdie tegniek dien die fragment van DNS wat geamplifiseer moet word as die templaat en DNS-polimerase-ensiem voeg komplementêre nukleotiede by die primer wat beskikbaar is in die PCR-mengsel. Aan die einde van die PCR-reaksie word baie kopieë van die monster-DNS gesintetiseer.
Daar is verskillende komponente van die PCR-mengsel, insluitend DNA, DNA-polimerase (Taq-polimerase), primers (voorwaartse en omgekeerde primers), nukleotiede (boublokke van DNA) en 'n buffer. PCR gebeur binne 'n PCR-masjien, en die korrekte PCR-mengsel moet in die masjien gelaai word, en die korrekte program moet aangedryf word. Hierdie tegniek maak die produksie van duisende tot miljoene kopieë van 'n spesifieke gedeelte van DNS moontlik uit 'n baie klein hoeveelheid DNS.
PCR-reaksies vind op 'n sikliese manier plaas om die sigbare hoeveelheid PCR-produkte op 'n jel te produseer. Daar is drie hoofstappe betrokke by 'n PKR-reaksie, naamlik denaturering, primer-gloeiing en strengverlenging soos in Figuur 01 getoon. Hierdie drie stappe vind plaas by drie verskillende temperature. DNA bestaan in dubbelstrengs vorm deur waterstofbindings tussen die komplementêre basisse. Voor implikasie moet dubbelstrengs DNA van mekaar geskei word. Dit word gedoen deur 'n hoë temperatuur te gee. By 'n hoë temperatuur denatureer dubbelstrengs DNA in enkelstringe. Dan moet die primers nader aan die flankerende punte van die spesifieke fragment of die geen van die DNA kom. Primer is 'n kort stuk enkelstrengs DNA wat aanvullend tot die teikenvolgorde is. Voorwaartse en omgekeerde primers gloei met die komplementêre basisse by die flankerende punte van die gedenatureerde monster DNA by die uitgloeitemperatuur. Primers moet hittebestand wees. Sodra primers gloei met monster-DNS, begin taq-polimerase-ensiem die sintese van die nuwe stringe deur nukleotiede by te voeg wat aanvullend tot die teiken-DNS is. Taq-polimerase is 'n hittebestendige ensiem wat uit 'n termofiele bakterie genaamd Thermus aquaticus geïsoleer is. PCR buffer handhaaf die optimale toestande vir die taq polimerase aksie. Hierdie drie stadiums van PCR-reaksies word herhaal om die benodigde hoeveelheid PCR-produk te produseer. Na elke PCR-reaksie word die nommer van die DNA-kopie verdubbel. Gevolglik kan 'n eksponensiële amplifikasie in PCR waargeneem word. PCR-produkte kan met behulp van gelelektroforese waargeneem word en kan gesuiwer word vir verdere studies.
Figuur 01: Groot stappe van 'n PCR-reaksie
PCR is 'n waardevolle hulpmiddel in mediese en biologiese navorsing. PCR het 'n spesiale waarde in forensiese wetenskap, aangesien dit DNS kan versterk vir studies uit die klein monsters van die misdadigers en forensiese DNS-profiele kan maak. PCR word wyd gebruik in baie gebiede van molekulêre biologie, insluitend genotipering, geenkloning, mutasie-opsporing, DNA-volgordebepaling, DNA-mikroskikkings en vaderskaptoetsing, ens.
Figuur 02: Polimerase-kettingreaksie
Wat is DNA-volgordebepaling?
DNA-volgordebepaling is die bepaling van 'n presiese volgorde van die nukleotiede – adenien, guanien, sitosien en timien in 'n gegewe DNA-fragment. Genetiese inligting word in die DNA-volgordes gestoor deur die korrekte volgorde van die nukleotiede te gebruik. Om die presiese volgorde van die nukleotiede in 'n DNS-fragment te vind, is dus baie belangrik om te weet oor die struktuur en funksie van die gene.
DNA-volgordebepalingsprotokol behels verskillende prosesse. Die eerste stap is die isolasie van geïnteresseerde DNA of genomiese DNA van 'n organisme. Deur gebruik te maak van PCR (soos hierbo beskryf), moet die gewenste streek van die DNA geamplifiseer word. Geamplifiseerde PCR-produk moet geskei word deur die gelelektroforese en gesuiwer word. Versterkte fragmente word as sjablone vir volgordebepaling bedien. Volgordebepaling kan gedoen word óf volgens Sanger-volgordebepaling óf 'n hoë deursetvolgorde-metode. Sanger-volgordebepaling vereis kapillêre elektroforese van resulterende DNA-fragmente. Bepaling van die korrekte nukleotiedvolgorde kan gedoen word deur handmatige lees van outoradiograwe of deur geoutomatiseerde DNS-volgorders te gebruik.
Geenvolgordebepaling het bygedra tot die Menslike genoomprojek en het die kartering van die menslike genoom in 2003 gefasiliteer. In forensiese ondersoeke het DNS-volgordebepaling identifikasie moontlik gemaak van individue wat unieke DNS-volgorde toon en die misdadigers identifiseer. In die geneeskunde kan DNS-volgordebepaling gebruik word om die gene wat verantwoordelik is vir genetiese en ander siektes op te spoor, gebrekkige gene te vind en dit met korrekte gene te vervang. In die landbou word DNS-volgorde-inligting van sommige mikroörganismes gebruik om transgeniese gewasse met ekonomies gewenste eienskappe te produseer.
Figuur 03: DNA-volgordebepaling
Wat is die verskil tussen PCR en DNA-volgordebepaling?
PCR vs DNA-volgordebepaling |
|
| PCR-proses skep duisende tot miljoene kopieë van die belangstellende DNS-fragment. | DNA-volgordebepaling is die proses om die presiese volgorde van die nukleotiede in 'n gegewe DNA-fragment te bepaal. |
| Uitkoms | |
| PCR skep duisende tot miljoene kopieë van 'n spesifieke DNS-fragment | Dit lei tot die korrekte volgorde van die basisse in 'n spesifieke DNS-fragment. |
| Betrokkenheid van ddNTP's | |
| PCR vereis nie ddNTP's nie. Dit gebruik dNTP's. | DNA-volgordebepaling vereis ddNTP's om stringvorming te beëindig. |
Opsomming – PCR vs DNA-volgordebepaling
PCR en DNA-volgordebepaling is baie belangrike instrumente in baie gebiede van Molekulêre Biologie. Amplifikasie van die DNS-fragmente word deur die PKR-tegniek gedoen terwyl die korrekte volgorde van die nukleotiede van 'n DNS-fragment deur die DNS-volgordebepaling bepaal word. Dit is die verskil tussen PCR en DNA-volgordebepaling.
