Sleutelverskil – PCR Primers vs Sequencing Primers
Met die onlangse ontwikkelings op die gebied van molekulêre biologie is verskillende genetiese tegnieke ontwikkel wat die ondersoekprosesse van verskillende weë van die vak maklik en akkuraat gemaak het. PCR en ander volgordebepalingsprosedures is twee belangrike sulke tegnieke. Hulle gebruik verskillende subkomponente. Primers word beskou as die belangrikste sub-komponent wat algemeen is vir beide PCR en Sequencing tegnieke. PCR-inleiders word gebruik vir amplifikasie van 'n spesifieke DNA-volgorde terwyl volgordebepaling-inleiders gebruik word in die konteks van volgordebepaling van 'n DNS-fragment met die bedoeling om die spesifieke volgorde van die nukleotiedvolgorde te openbaar. Dit is die sleutelverskil tussen PCR-inleiders en volgordebepaling-inleiders.
Wat is PCR-primers?
Polymerase kettingreaksie (PCR) is 'n genetiese tegniek wat in die veld van molekulêre biologie gebruik word om 'n enkele of min kopieë van 'n bepaalde DNS-segment te versterk en om baie miljoene identiese kopieë te verkry. In 'n PCR-reaksie word verskillende komponente gebruik, insluitend primers. Primers is kort DNS-stringe met 'n nukleotiedlengte van 18-25 wat hulle versoenbaar maak met die begin- en eindgebied van die DNS-fragmente wat geamplifiseer moet word. Primers kan 'n voor- en omgekeerde onderlaag wees. Hierdie primers bind aan die DNS-fragment op die spesifieke punte waar dit DNS-polimerase maak om aan die spesifieke primer op die plek te bind en die sintese van die nuwe DNS-string te inisieer.
Die keuse van primers is 'n belangrike aspek van PCR-proses. Die keuse van die lengte van die onderlaag is belangrik. Die ideale lengte sal 18-25 nukleotiede wees. As die lengte te kort of te lank is, sal die primers nie aan die DNA-volgorde bind om akkuraat geamplifiseer te word nie. Primers wat te kort in lengte is lei tot nie-spesifieke primer-gloeiing op verskillende plekke van die DNA-volgorde.
Figuur 01: PCR Primers
Die guanien- en sitosien- (GC)-inhoud in 'n goeie onderlaag moet in die reeks van 40-60 wees. Die primer-gloeitemperatuur en smelttemperatuur is belangrike faktore tydens PCR. Die smelttemperatuur moet akkuraat bereken word, en die onderlaag-gloeitemperatuur moet 5 0C minder as die smelttemperatuur wees. Die smelttemperatuur moet 60 °C en 75 °C wees. Te hoë of te lae temperature sal minder aktiewe DNA-polimerase-aktiwiteit tot gevolg hê.
Wat is Sequencing Primers?
Volksorde-inleiders word gebruik in die konteks van volgordebepaling van 'n DNS-fragment met die doel om sy spesifieke identiteit te openbaar. Om goeie volgorde resultate te verkry, is hoë kwaliteit primers en sjablone belangrik. Dus, wanneer primers gekies word, moet hulle uniek wees aan 'n spesifieke streek waar ons begeer om te volgorde. Dit moet ook met 'n korrekte oriëntasie wees waar die rye gewoonlik gegenereer word vanaf 3' tot 5' ente van die primers. Die volgorde moet nie ongewenste selfhibridisering soos die vorming van haarnaaldlusse hê nie. Dit moet nie opeenvolgende vorming van guanienbasisse bevat nie.
Die smelttemperatuur (Tm) van die onderlaag moet geskik wees vir die toestande van die volgordebepaling. Daarom moet dit tussen 52oC en 74oC lê. Voorbereiding van oligonukleotiede om as 'n primer gebruik te word, moet gesuiwer word om die verlangde volle lengte van die volgorde te verkry. As die oligonukleotiede onsuiwerhede bevat, sal die primervolgorde-sein vanaf verskillende priming-plekke gesuperponeer word, en dit sal ook die aantal basisselle verminder.
Figuur 02: Volgorde-primers
Die primer-smelttemperatuur (Tm) van 'n oligonukleotied bepaal hoe sterk die komplementêre DNA-stringe met mekaar gehibridiseer word. Tm kan beskou word as 'n termodinamiese berekening waar dit afhanklik is van beide DNS-volgordes en verskeie toestande soos soutkonsentrasie. Die Tm is belangrik tydens PCR waar 'n variant genaamd die siklusvolgordebepaling gebruik word om 'n groep dideoksinukleotied-getermineerde fragmente te produseer. Hier sal die primer wat gevolgorde word aanvanklik alternatiewelik uitgegloei word, dan verleng en laastens gedenatureer word vir amplifikasie. Daarom moet die Tm-waarde tussen 52oC en 74o C wees. Gesintetiseerde oligonukleotiede kan van DNA/RNA-sintese-laboratoriums verkry word soos per keuse. Die klein skaal van sintese wat vir DNA-volgordebepaling gebruik word, is gewoonlik 50 nmol. Die belangrikste is ook dat die primers wat vir volgordebepaling gebruik word, gesuiwer moet word om vry van onsuiwerhede te wees wat die kwaliteitvermindering sal voorkom.
Wat is die ooreenkomste tussen PCR-primers en volgorde-primers?
- Beide PCR Primers en Sequencing Primers is primers wat gebruik word in die amplifikasieproses van 'n geteikende DNA-volgorde.
- Beide PCR-primers en volgordebepaling-primers is saamgestel uit nukleotiede.
- Beide PCR Primers en Sequencing Primers is kort oligomere.
Wat is die verskil tussen PCR-primers en volgorde-primers?
PCR Primers vs Sequencing Primers |
|
| PCR-inleiders is kort DNS-stringe met 'n nukleotiedvolgordelengte van 18-25 wat hulle versoenbaar maak met die begin- en eindgebied van die DNS-fragmente wat geamplifiseer moet word. | Volksorde-inleiders is kort oligomere wat gebruik word in die konteks van volgordebepaling van 'n DNS-fragment met die doel om sy spesifieke identiteit te openbaar. |
| Funksie | |
| PCR-inleiders word gebruik vir amplifikasie van 'n spesifieke DNS-volgorde. | Volksorde-inleiders word gebruik in die konteks van volgordebepaling van 'n DNS-fragment met die doel om sy spesifieke identiteit te openbaar. |
| Aantal primers benodig | |
| Twee primers; een vorentoe primer en een reverse primer word as PCR primers gebruik. | Benodig net een primer as volgorde primer. |
Opsomming – PCR Primers vs Sequencing Primers
Volksorde-inleiders word gebruik in die konteks van volgordebepaling van 'n DNS-fragment met die doel om sy spesifieke identiteit te openbaar. Een volgorde-onderlaag sal genoeg wees om die proses uit te voer. Om goeie volgorde resultate te verkry, is hoë kwaliteit onderlaag en sjablone belangrik. Dus, wanneer primers gekies word, moet hulle uniek wees aan 'n spesifieke streek waar ons begeer om te volgorde. PCR Primers is kort DNS-stringe met 'n nukleotiedlengte van 18-25 wat versoenbaar is met die begin- en eindgebied van die DNS-fragmente wat geamplifiseer moet word. PCR primers kan 'n voorwaartse primer en reverse primer wees. Die guanien- en sitosieninhoud (GC) in 'n goeie onderlaag moet in die reeks van 40-60 wees. Die primer-gloeitemperatuur en smelttemperatuur is belangrike aspekte tydens PCR. Dit is die verskil tussen PCR-inleiders en volgordebepaling-inleiders.
