Sleutelverskil – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotiede is die basiese strukturele eenhede en boustene van DNS. DNA-molekule is saamgestel uit 'n polinukleotiedketting. Daar is vier verskillende nukleotiede wat in DNA gevind word. Hierdie nukleotiede bestaan uit vier verskillende stikstofbasisse genaamd A (adenien), G (guanien), C (sitosien), T (timien). Die volgorde van die nukleotiede in die DNA-molekule is van groot belang aangesien dit 'n belangrike genetiese inligting vir organismes se groei en ontwikkeling kodeer. DNA-volgordebepaling verwys na die proses wat die presiese nukleotiedvolgorde van die DNA bepaal. Daar is verskillende DNS-volgordebepalingsmetodes. Maxam Gilbert-volgordebepaling en Sanger DNA-volgordebepaling is twee metodes van DNA-volgordebepaling wat tot die eerste generasie volgordebepaling behoort. Maxam Gilbert-volgordebepalingsprosedure bepaal die basisvolgorde deur die 5'-einde gemerkte DNA-fragmente chemies te splits by elk van vier nukleotiede en gelelektroforese. Sanger-volgordebepalingsprosedure bepaal die nukleotiedvolgorde deur enkelstring-DNS te sintetiseer deur DNA-polimerase en dideoksinukleotiede en gelelektroforese te gebruik. Dit is die sleutelverskil tussen Maxam Gilbert en Sanger Sequencing.
Wat is Maxam Gilbert Sequencing?
Maxam Gilbert-volgordebepaling, ook bekend as chemiese volgordebepalingmetode, is 'n tegniek wat ontwikkel is om die volgorde van die nukleotiede in DNA te bepaal. Hierdie metode is in 1976 deur W alter Gilbert en Alan Maxam bekendgestel en het gewild geword aangesien dit direk met gesuiwerde DNA uitgevoer kan word. Maxam Gilbert-metode behoort tot die eerste generasie DNA-volgordebepaling, en dit was die eerste volgordebepalingsmetode wat wyd deur wetenskaplikes gebruik is.
Die basiese beginsel van hierdie metode lê by die beperking van die eindgemerkte DNS-fragmente by spesifieke basisse deur basisspesifieke chemikalieë en toestande en skeiding van die gemerkte fragmente deur elektroforese soos in figuur 01 getoon. Fragmente word geskei volgens na hul groottes op die gel. Aangesien die fragmente gemerk is, kan die volgorde van die DNA-molekule maklik afgelei word.
Maxam gilbert-metode gebruik basis-spesifieke chemikalieë om DNA by spesifieke basisse te breek. Twee algemene chemikalieë genaamd dimetielsulfaat en hidrasienchemikalieë word gebruik om onderskeidelik puriene en pirimidiene selektief aan te val.
Maxam Gilbert-volgordemetode word deur verskeie stappe soos volg uitgevoer.
- Suiwering van die DNA-volgorde deur gebruik te maak van beperking-endonukleases
- Etikettering van die punte van die DNA-fragmente deur radioaktiewe fosfate by te voeg
- Suiwering van die gemerkte fragmente van nie-gemerkte fragmente deur gelelektroforese
- Skei van die eind-gemerkte DNA in vier buise en behandeling met basis spesifieke chemikalieë afsonderlik
- Elektroforese van die inhoud van elke buis op aparte lyne op 'n jel en fragmentskeiding volgens hul lengte.
- Opsporing van die fragmente deur outoradiograaf.
Figuur 01: Maxam Gilbert-volgorde
Wat is Sanger-volgorde?
Sanger-volgordebepaling is 'n volgordebepalingsmetode wat in 1977 deur Frederick Sanger en sy kollegas ontwikkel is om die basisvolgorde van 'n gegewe DNS-fragment te bepaal. Dit staan ook bekend as kettingbeëindiging-volgordebepaling of Dideoxy-volgordebepalingsmetode. Hierdie metode werk op die beginsel van selektiewe inkorporering van kettingterminerende dideoksinukleotiede (ddNTPs) soos ddGTP, ddCTP, ddATP en ddTTP deur DNA-polimerase tydens die sintese van enkelstring-DNS om stringvorming te beëindig. Dideoksinukleotiede het nie 3' OH-groepe vir die vorming van fosfodiesterbindings met aangrensende nukleotied. Dus stop die stringvorming sodra 'n ddNTP in nuutvormende string geïnkorporeer is tydens sanger-volgordebepaling.
In hierdie metode word vier afsonderlike DNA-sintese-reaksies (PCR) uitgevoer in vier afsonderlike buise met een tipe ddNTP. Ander vereistes word ook voorsien vir die buise vir PCR, insluitend primers, dNTP's, Taq-polimerase, spesifieke toestande, ens. Vier afsonderlike reaksies word in vier buise met vier mengsels uitgevoer. Na PCR-reaksies word resulterende DNA-fragmente hitte gedenatureer en geskei deur gelelektroforese. Dan word die fragmente gevisualiseer deur óf 'n gemerkte (radioaktiewe of fluoresserende) onderlaag óf dNTP's te gebruik soos in figuur 02 getoon.
Figuur 02: Sanger-volgorde
Wat is die verskil tussen Maxam Gilbert en Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert-volgordebepaling is die eerste tegniek wat ontwikkel is vir DNA-volgordebepaling. | Sanger-volgorde-metode is na die Maxam Gilbert-volgorde-metode bekendgestel. |
| Gebruik | |
| Hierdie metode word selde gebruik. | Sanger-volgorde word gereeld vir volgordebepaling gebruik. |
| Gebruik van gevaarlike chemikalieë | |
| Dit gebruik gevaarlike chemikalieë. | Gebruik van gevaarlike chemikalieë is beperk in vergelyking met Maxam Gilbert-metode. |
| Etikettering vir opsporing | |
| Hierdie metode gebruik radioaktiewe P32 vir die etikettering van die punte van die DNA-fragmente. | Sanger-volgordebepaling gebruik radioaktief of fluoresserend gemerkte ddNTP's. |
Opsomming – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert- en Sanger-volgordebepaling is twee tipes DNA-volgordebepalingstegnieke wat onder die eerste generasie DNA-volgordebepaling kom. Maxam Gilbert-volgordebepaling is die eerste metode wat in 1976 vir DNA-volgordebepaling bekendgestel is, en dit word uitgevoer deur die eindgemerkte DNA-fragmente deur basisspesifieke chemikalieë te breek. Daarom staan dit bekend as chemiese volgordebepaling. Sanger-volgordebepalingsmetode is in 1977 bekendgestel en is gebaseer op die ddNTP-gedrewe kettingbeëindigingsreaksies. Sanger-volgorde-metode gewild as Maxam Gilbert-metode as gevolg van verskeie nadele van Maxam Gilbert-metode soos oormatige tydverbruik, gebruik van gevaarlike chemikalieë, ens. Dit is die verskil tussen Maxam Gilbert- en Sanger-volgordebepaling.
