Sleutelverskil – Sanger-volgordebepaling vs pyrosevolgorde
DNS-volgordebepaling is baie belangrik vir DNS-analise aangesien kennis van die korrekte nukleotiederangskikking op 'n spesifieke DNS-gebied baie belangrike inligting daaroor openbaar. Daar is verskillende DNS-volgordebepalingsmetodes. Sanger-volgordebepaling en Pyrosevolgordebepaling is twee verskillende DNA-volgordebepalingsmetodes wat wyd in Molekulêre Biologie gebruik word. Die sleutelverskil tussen Sanger-volgordebepaling en Pyrosevolgordebepaling is dat Sanger-volgordebepaling dideoksinukleotiede gebruik om die sintese van DNA te beëindig om die nukleotiedvolgorde te lees, terwyl pirofosfaatvrystelling opspoor deur die nukleotiede in te sluit en die komplementêre volgorde van die komplementêre volgorde te lees.
Wat is Sanger-volgorde?
Sanger-volgordebepaling is 'n eerste generasie DNA-volgordebepalingsmetode wat in 1977 deur Frederick Sanger en sy kolleges ontwikkel is. Dit staan ook bekend as Kettingbeëindiging-volgordebepaling of Dideoksie-volgordebepaling aangesien dit op kettingbeëindiging deur dideoksinukleotiede (ddNTP's) gebaseer is. Hierdie metode is wyd gebruik vir meer as 30 jaar totdat die New Generation Sequencing (NGS) ontwikkel is. Sanger-volgordebepalingstegniek het die ontdekking van die korrekte nukleotiedorde of die aanhegting van 'n spesifieke DNS-fragment moontlik gemaak. Dit is gebaseer op die selektiewe inkorporering van ddNTP's en beëindiging van DNA-sintese tydens die in vitro DNA-replikasie. Die afwesigheid van 3' OH-groepe om fosfodiesterbindingsvorming tussen aangrensende nukleotiede voort te sit, is 'n unieke kenmerk van ddNTP's. Dus, sodra die ddNTP aangeheg is, hou kettingverlenging op en eindig vanaf daardie punt. Daar is vier ddNTP's – ddATP, ddCTP, ddGTP en ddTTP – wat in Sanger-volgordebepaling gebruik word. Hierdie nukleotiede stop die DNA-replikasieproses wanneer hulle in die groeiende DNA-string geïnkorporeer word en lei tot verskillende lengtes van kort DNA. Kapillêre gelelektroforese word gebruik om hierdie kort DNS-stringe volgens hul groottes op 'n jel te organiseer soos in Figuur 01 getoon.
Figuur 1: Kapillêre gelelektroforese van gesintetiseerde kort DNA
Vir in vitro-replikasie van DNA moet min vereistes voorsien word. Dit is DNA-polimerase-ensiem, templaat-DNA, oligonukleotied-inleiders en deoksinukleotiede (dNTP's). In Sanger-volgordebepaling word DNA-replikasie in vier afsonderlike proefbuise uitgevoer saam met vier tipes ddNTP's afsonderlik. Deoksinukleotiede word nie heeltemal deur die onderskeie ddNTP's vervang nie. 'n Mengsel van die spesifieke dNTP (byvoorbeeld; dATP + ddATP) word in die buis ingesluit en gerepliseer. Vier afsonderlike buisprodukte word op 'n jel in vier aparte putte uitgevoer. Deur dan die jel te lees, kan die volgorde gekonstrueer word soos in Figuur 02 getoon.
Figuur 02: Sanger-volgorde
Sanger-volgordebepaling is 'n belangrike tegniek wat op baie gebiede van molekulêre biologie help. Menslike genoomprojek is suksesvol voltooi met behulp van Sanger-volgordebepaling-gebaseerde metodes. Sanger-volgordebepaling is ook nuttig in teiken-DNS-volgordebepaling, kanker- en genetiese siektenavorsing, geenuitdrukking-analise, menslike identifikasie, patogeenopsporing, mikrobiese volgordebepaling, ens.
Daar is verskeie nadele van Sanger-volgordebepaling:
- Die lengte van die DNS wat gevolgorde word, kan nie langer as 1000 basispare wees nie
- Slegs een string kan op 'n slag gerangskik word.
- Die proses is tydrowend en duur.
Daarom is nuwe gevorderde volgordebepalingtegnieke mettertyd ontwikkel om hierdie probleme te oorkom. Sanger-volgordebepaling is egter steeds in gebruik as gevolg van sy hoogs akkurate resultate tot ongeveer 850 basispaarlengtefragmente.
Wat is Pyrosequencing?
Pyrosequencing is 'n nuwe DNA-volgordebepalingstegniek gebaseer op die "volgordebepaling deur sintese". Hierdie tegniek maak staat op die opsporing van pirofosfaatvrystelling by die inkorporering van nukleotied. Die proses word deur vier verskillende ensieme aangewend: DNS-polimerse, ATP-sulfurilase, luciferase en apirase en twee substrate adenosien 5'-fosfosulfaat (APS) en luciferin.
Die proses begin met die primer wat met die enkelstring-DNS-sjabloon bind en DNA-polimerase begin die inkorporering van nukleotiede komplementêr daaraan. Wanneer die nukleotiede by mekaar aansluit (nukleïensuurpolimerisasie), stel dit pirofosfaatgroepe en energie vry. Elke nukleotiedbyvoeging stel ekwimolêre hoeveelheid pirofosfaat vry. Pirofosfaat omskep in ATP deur ATP-sulfurilase in die teenwoordigheid van substraat APS. Die gegenereerde ATP dryf die lusiferase-gemedieerde omskakeling van luciferien na oksielusiferien aan, wat sigbare lig produseer in hoeveelhede wat eweredig is aan die hoeveelheid ATP's. Lig word opgespoor deur 'n fotonopsporingstoestel of deur fotovermenigvuldiger en skep 'n pirogram. Apirase breek ATP en nie-geïnkorporeerde dNTP's in die reaksiemengsel af. dNTP-byvoeging word een keer op 'n slag gedoen. Aangesien die toevoeging van nukleotied bekend is volgens die inkorporering en opsporing van lig, kan die volgorde van die templaat bepaal word. Pirogram word gebruik vir die generering van die nukleotiedvolgorde van die monster-DNA soos getoon in Figuur 03.
Pirosequencing is baie belangrik in enkelnukleotied-polimorfisme-analise en volgordebepaling van kort dele DNA. Die hoë akkuraatheid, buigsaamheid, gemak van outomatisering en parallelle verwerking is die voordele van pyrosequencing bo Sanger-volgordebepalingstegnieke.
Figuur 03: Pyrosequencing
Wat is die verskil tussen Sanger Sequencing en Pyrosequencing?
Sanger-volgorde vs Pyrose-volgorde |
|
| Sanger-volgordebepaling is 'n DNS-volgordebepalingsmetode gebaseer op die selektiewe inkorporering van ddNTP's deur DNS-polimerase en kettingterminasie. | Pyrosequencing is 'n DNA-volgordebepalingsmetode gebaseer op die opsporing van pirofosfaatvrystelling by die inkorporering van nukleotied. |
| Gebruik van ddNTP | |
| ddNTP's word gebruik om die DNA-replikasie te beëindig | ddNTP's word nie gebruik nie. |
| Ensieme betrokke | |
| DNA-polimerase word gebruik. | Vier ensieme word gebruik: DNA-polimerase, ATP-sulfurilase, Luciferase en Apirase. |
| substrate gebruik | |
| APS en Luciferin word nie gebruik nie. | Adenosien 5'-fosfosulfaat (APS) en lusiferien word gebruik. |
| Maksimum temperatuur | |
| Dit is 'n stadige proses. | Dit is 'n vinnige proses. |
Opsomming – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-volgordebepaling en Pyrosevolgordebepaling is twee DNS-volgordebepalingsmetodes wat in molekulêre biologie gebruik word. Sanger-volgordebepaling konstrueer die volgorde van die nukleotiede in volgorde deur die kettingverlenging te beëindig, terwyl die pirosevolgordebepaling die presiese volgorde van die nukleotiede in volgorde konstrueer deur nukleotiede in te sluit en die vrystelling van pirofosfate op te spoor. Daarom is die belangrikste verskil tussen Sanger-volgordebepaling en Pyrosequencing dat Sanger-volgordebepaling werk op volgordebepaling deur kettingbeëindiging terwyl pyrosequencing op volgordebepaling deur sintese werk.
