Sleutelverskil – NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) en Sanger Sequencing is twee tipes nukleotied-volgordebepalingstegnieke wat oor die tyd ontwikkel is. Sanger Sequencing-metode is vir baie jare wyd gebruik en NGS het dit onlangs vervang as gevolg van sy voordele. Die sleutelverskil tussen NGS en Sanger Sequencing is dat NGS op die beginsel werk om miljoene sekwensies gelyktydig op 'n vinnige manier deur 'n volgordebepalingstelsel te volgorde, terwyl die Sanger Sequencing op die beginsel van kettingterminasie werk as gevolg van selektiewe inkorporering van dideoksinukleotiede deur DNA-polimerase-ensiem tydens die DNA-replikasie en gevolglike fragmentskeiding deur kapillêre elektroforese.
Wat is nukleotiedvolgorde?
Genetiese inligting word in die nukleotiedvolgordes van die DNA of RNA van 'n organisme gestoor. Die proses om die korrekte volgorde van nukleotiede (met behulp van vier basisse) in 'n gegewe fragment (in 'n geen, groep gene, chromosoom en volledige genoom) te bepaal, staan bekend as nukleotiedvolgordebepaling. Dit is baie belangrik in genomiese studies, forensiese studies, virologie, biologiese sistematiese, mediese diagnose, biotegnologie en in baie ander velde om die struktuur en funksie van gene te ontleed. Daar is verskillende tipes volgordebepalingmetodes wat deur wetenskaplikes ontwikkel is. Onder hulle is Sanger-volgordebepaling wat in 1977 deur Frederick Sanger ontwikkel is, wyd gebruik en vir 'n lang tydperk gewild gemaak totdat Next Generation Sequencing dit vervang het.
Wat is NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) is 'n term wat gebruik word om te verwys na moderne hoë deurset-volgordeprosesse. Dit beskryf 'n aantal verskillende moderne volgordebepalingtegnologieë wat genomiese studies en molekulêre biologie 'n rewolusie laat ontstaan het. Daardie tegnieke is Illumina-volgordebepaling, Roche 454-volgordebepaling, Ion Proton-volgordebepaling en SOLiD (volgordebepaling deur Oligo Ligation Detection) volgordebepaling. NGS-stelsels is vinniger en goedkoper. Vier hoof DNS-volgordebepalingsmetodes word in NGS-stelsels gebruik, naamlik; pyrosevolgordebepaling, volgordebepaling deur sintese, volgordebepaling deur ligasie en ioonhalfgeleiervolgordebepaling. 'n Groot aantal DNA- of RNA-stringe (miljoene van) kan parallel gerangskik word. Dit laat volgordebepaling van die hele genoom van organismes binne 'n kort tydperk toe, anders as Sanger-volgordebepaling wat meer tyd neem.
NGS het baie voordele bo die konvensionele volgordebepaling Sanger-metode. Dit is 'n hoëspoed, meer akkurate en koste-effektiewe proses wat met 'n klein steekproefgrootte uitgevoer kan word. NGS kan gebruik word in metagenomiese studies, in die opsporing van variasies binne 'n individuele genoom as gevolg van invoegings en delesies ens. en in die ontleding van geenuitdrukkings.
Figuur_1: Ontwikkelings in NGS-volgorde
Wat is Sanger-volgorde?
Sanger-volgordebepaling is 'n volgordebepalingsmetode wat in 1977 deur Frederick Sanger en sy kollegas ontwikkel is om die presiese nukleotiedvolgorde van 'n gegewe DNS-fragment te bepaal. Dit staan ook bekend as kettingbeëindiging-volgordebepaling of Dideoxy-volgordebepaling. Die werksbeginsel van hierdie metode is die beëindiging van stringsintese deur selektiewe inkorporering van 'n kettingterminerende dideoksinukleotiede (ddNTP's) soos ddGTP, ddCTP, ddATP en ddTTP deur DNA-polimerase tydens die replikasie van DNA. Normale nukleotiede het 3' OH-groepe vir die vorming van 'n fosfodiesterbinding tussen aangrensende nukleotiede om die stringvorming voort te sit. ddNTP's het egter nie hierdie 3' OH-groep nie en is nie in staat om fosfodiesterbindings tussen nukleotiede te vorm nie. Gevolglik word die kettingverlenging gestaak.
In hierdie metode dien die enkelstring-DNS wat georden moet word as die templaatstring vir in vitro DNA-sintese. Ander vereistes is oligonukleotied primer, deoksinukleotied voorlopers en DNA polimerase ensiem. Wanneer die flankerende punte van die teikenfragment bekend is, kan primers maklik ontwerp word vir DNA-replikasie. Vier afsonderlike DNA-sintesereaksies word in vier afsonderlike buise uitgevoer. Elke buis het aparte ddNTP's, tesame met ander vereistes. Van die spesifieke nukleotied word 'n mengsel van dNTP's en ddNTP's bygevoeg. Net so word vier afsonderlike reaksies in vier buise met vier mengsels uitgevoer. Na die reaksies word die opsporing van DNS-fragmente en omskakeling van die fragmentpatroon in volgorde-inligting uitgevoer. Gevolglike DNS-fragmente word hitte gedenatureer en geskei deur gelelektroforese. Indien radioaktiewe nukleotiede gebruik word, kan die bandpatroon in die poliakrielamiedgel deur outoradiografie gevisualiseer word. Wanneer hierdie metode die fluoresserend gemerkte dideoksinukleotiede gebruik, kan dit verminder word deur die gel wat gelees is en deur 'n laserstraal gevoer word om deur die fluoresserende detektor opgespoor te word. Om foute te vermy wat kan ontstaan wanneer 'n sekwens deur die oog gelees word en met die hand in 'n rekenaar ingevoer word, het hierdie metode ontwikkel in die gebruik van geoutomatiseerde sekwenser saam met die rekenaar.
Dit is die metode wat gebruik word om DNA van die Menslike Genoom-projek te volgorde. Hierdie metode is steeds in gebruik met gevorderde wysigings omdat dit akkurate volgorde-inligting gee, al is dit 'n duur en stadige proses.
Figure_2: Sanger-volgorde
Wat is die verskil tussen NGS en Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) verwys na moderne hoë deurset-volgordeprosesse. Dit beskryf 'n aantal verskillende moderne volgordebepalingtegnologieë | Sanger-volgordebepaling is 'n volgordebepalingsmetode wat deur Frederick Sanger ontwikkel is om die presiese nukleotiedvolgorde van 'n gegewe DNS-fragment te bepaal. |
| Kostedoeltreffendheid | |
| NGS is 'n goedkoper proses omdat dit tyd, mankrag en chemikalieë verminder. | Dit is 'n duur proses, want dit neem tyd, mankrag en meer chemikalieë. |
| Speed | |
| Dit is vinniger aangesien beide chemiese opsporing en seinbespeuring van baie stringe parallel plaasvind. | Dit is tydrowend aangesien chemiese opsporing en seinbespeuring as twee afsonderlike prosesse plaasvind en slegs op string op 'n slag kan lees. |
| Betroubaarheid | |
| NGS is betroubaar. | Sanger-volgordebepaling is minder betroubaar |
| Voorbeeldgrootte | |
| NGS vereis minder hoeveelheid DNA. | Hierdie metode benodig 'n groot hoeveelheid sjabloon-DNA. |
| DNA-basisse per opeenvolgende fragment | |
| Die aantal DNA-basisse per opeenvolgende fragment is laer as Sanger-metode | Genereer-reekse is langer as NGS-reekse. |
Opsomming – NGS vs Sanger Sequencing
NGS en Sanger-volgordebepaling is nukleotiedvolgordebepalingstegnieke wat wyd in Molekulêre Biologie gebruik word. Sanger-volgordebepaling is 'n vroeë volgordebepalingsmetode wat deur NGS vervang is. Die belangrikste verskil tussen NGS en Sanger-volgordebepaling is dat NGS 'n hoëspoed, meer akkurate en koste-effektiewe proses is as Sanger-volgordebepaling. Albei tegnieke het groot uitbrake in genetika en biotegnologie veroorsaak.
