Sleutelverskil – Kloning vs Subkloning
Kloning en Subkloning is molekulêre biologiese prosedures wat geneties identiese selle of organismes skep wat die DNA of geen dra wat van belang is. Kloning is 'n tegniek wat die invoeging van die belangstellende geen of DNS in 'n vektor behels, replisering daarvan binne 'n gasheerbakterie, en produksie van selle of organismes wat presiese kopieë van die genetiese samestelling is. Subkloning is 'n tegniek wat die invoeging van die geen van belang, wat reeds in 'n vektor ingevoeg is, in 'n sekondêre vektor, replikasie daarvan binne 'n gasheerbakterie en produksie van geneties identiese kopieë van selle of organismes behels. Die sleutelverskil tussen kloning en subkloning is dat, in kloning, die geen van belang, sodra dit in 'n vektor gelig is, die kloningsproses voortgaan terwyl, in die subkloning, die reeds gekloonde geen van belang van die ouervektor geskei word en weer ingevoeg word in 'n ontvangervektor en gaan voort met die proses.
Wat is kloning?
Kloning is die prosedure wat geneties identiese organismes of selle produseer. In die natuur vind kloning plaas deur middel van ongeslagtelike voortplanting. Wanneer daar geen genetiese rekombinasie of verandering is nie, ontvang dogterselle dieselfde genetiese samestelling van die ouer. Prokariotiese en eukariotiese organismes skep klone deur binêre splitsing, bot, mitose, ens. In molekulêre biologie is kloning van gene of spesifieke fragmente van DNA 'n gewilde metode om die struktuur en funksie van daardie spesifieke DNA-afdeling te bestudeer.
Die hoofdoelwit van molekulêre kloning is om miljoene kopieë te maak van geneties identiese selle of organismes wat die DNS-fragment van belang dra (hoofsaaklik gene). Dit skep organismes met presiese genetiese kopieë van 'n ander. Spesifieke gene word hoofsaaklik in molekulêre studies gekloon om strukturele en funksionele inligting te verkry en vir DNA-volgordebepaling. Ook, vir die produksie van spesifieke proteïene of produkte op groot skaal, word kloning wyd gebruik.
Kloningprosedure
Die basiese stappe van kloningprosedure is soos volg.
- Identifisering en isolasie van die geen van belang. (Amplifikasie van die geen van belang deur PCR).
- Beperkingsvertering van die geen van belang (Beperking-endonuklease sny die geen).
- Beperkingsvertering van die vektor-DNS. (Vektor-DNS word ook gesny met dieselfde beperking-endonuklease).
- Invoeging van die geen in die vektor en vorming van die rekombinante molekule.
- Transformasie van die rekombinante vektor in 'n gasheerbakterie.
- Isolering en identifikasie van die getransformeerde bakterieë (plasmiedvektor moet 'n selekteerbare geen bevat, meestal 'n antibiotika-weerstandsgeen om getransformeerde bakterieë te skerm).
- Rekombinante geenuitdrukking binne die gasheer.
Figure_01: Kloningprosedure
Wat is subkloning?
Subkloning is 'n prosedure om 'n geen van belang van een vektor na 'n ander vektor te skuif om die uitdrukking van die geen te sien om die gewenste funksionaliteit van die geen te verkry. By hierdie metode is twee vektore betrokke; naamlik ouervektor en bestemmingsvektor. Gekloonde insetsels word weer in 'n tweede vektor in subkloning geskuif. Die doel van die oordrag van die geen van die eerste vektor na die tweede vektor is om iets te verkry wat nie deur die eerste vektor gedoen kon word nie of om 'n geen weer binne die reeds gekloonde fragment van DNA te skei en dit alleen uit te druk. Beperkingsensieme word aan die begin in hierdie prosedure gebruik.
Subkloningprosedure
Die basiese stappe van subkloning is soos volg.
- Met behulp van beperking-endonukleases, skeiding van die DNA van belang in die skenkerplasmied (ouervektor).
- Amplifikasie van die DNS van belang deur PCR te gebruik.
- Suiwering van die PCR-produk (DNA van belang) deur gelelektroforese.
- Oopmaak van die ontvangerplasmied deur dieselfde beperking-endonukleases wat gebruik word om DNA van belang in die ouerplasmied te skei.
- Ligering van die DNA van belang (geen) in die ontvangerplasmied om die gesubkloneerde plasmied te skep.
- Transformasie van die gesubkloneerde vektor na 'n bevoegde gasheerbakterie.
- Sifting van getransformeerde selle.
- Suiwering van die plasmied DNA en gebruik vir DNA-volgordebepaling of uitdrukking van die gene om die verlangde produkte te verkry.
Subkloning word uitgevoer by geleenthede waar een geen van die gekloonde groep gene isoleer of wanneer die geen van belang na 'n bruikbare plasmied oorgedra word om die presiese funksie van die geen van belang te sien.
Figure_02: Subkloningprosedure
Wat is die verskil tussen kloning en subkloning?
Kloning vs Subkloning |
|
| Kloning is die prosedure wat geneties identiese organismes of selle produseer. | Subkloning is 'n prosedure om 'n geen van belang van een vektor na 'n ander vektor te verskuif om die uitdrukking van die geen te sien om die gewenste funksionaliteit van die geen te verkry. |
| Proses | |
| Skei die DNA van belang van die organisme en een keer in 'n vektor ingevoeg en gekloon | Reeds gekloonde DNA word van die eerste vektor geskei en in 'n tweede vektor ingevoeg en gekloon. |
| Voeg beweging in via vektore | |
| Verskuif nie insetsels (DNA van belang) van een vektor na 'n ander vektor nie. | Skuif insetsels van ouervektor na bestemmingsvektor. |
Opsomming – Kloning vs Subkloning
Kloning skep geneties identiese selle of organismes met die ingevoegde geen of DNA van belang. Dit gaan voort deur die skeiding en invoeging van die DNA van belang in 'n vektor en uitdrukking binne 'n gasheerbakterie. Subkloning deel soortgelyke stappe met kloning. In subkloning word reeds gekloonde DNA-fragment (geen van belang) egter in 'n vektor ingevoeg en in 'n gasheerbakterie getransformeer. Dit is die belangrikste verskil tussen kloning en subkloning.
