Sleutelverskil – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green en Taqman is twee metodes wat gebruik word om die versterkingsproses van intydse PCR op te spoor of te kyk. SYBR Green is 'n metode wat gebaseer is op interkalerende nukleïensuurkleurstof terwyl Taqman 'n metode is wat gebaseer is op hidrolise-sonde. Beide tegnologieë is ontwerp om fluoressensie tydens die PCR te genereer, wat intydse PCR-masjien toelaat om die reaksie in "intydse" te monitor. SYBR Green-metode word uitgevoer met behulp van 'n fluoresserende kleurstof genaamd SYBR-groen en bespeur die versterking deur die kleurstof te bind aan geproduseerde dubbelstring-DNS. Taqman word uitgevoer met behulp van dubbel-gemerkte probes en bespeur die amplifikasie deur degradasie van die sonde deur Taq polimerase en vrystellings van die fluorofoor. Dit is die sleutelverskil tussen SYBR Green en Taqman.
Wat is SYBR Green?
SYBR Groen is 'n fluoresserende kleurstof wat gebruik word om nukleïensure te kleur, veral dubbelstring-DNS in Molekulêre Biologie. SYBR Groen metode word gebruik om PCR produkte te kwantifiseer tydens die intydse PCR. Sodra dit met DNA bind, absorbeer die resulterende DNA-kleurstofkompleks blou lig en straal intense groen lig uit. Dit gebeur as gevolg van die strukturele verandering wat in die kleurstofmolekule plaasvind by binding met dubbelstring-DNS. Wanneer PCR meer en meer DNA skep, bind meer kleurstofmolekules met DNA, wat meer fluoressensie genereer. Daarom neem die fluoressensie toe met die ophoping van die PCR-produk. Gevolglik kan die hoeveelheid PCR-produk kwantitatief gemeet word deur die SYBR Groen fluoressensie opsporing.
SYBR groen kleurstof kan ook gebruik word vir DNA-etikettering in sitometrie en fluoresserende mikroskopie. Ethidiumbromied is suksesvol deur SYBR Green vervang aangesien Ethidiumbromied 'n kankerverwekkende kleurstof is met wegdoeningsprobleme tydens DNA-visualisering in die jelelektroforese.
Daar is voordele en nadele van SYBR groen metode. Hierdie metode is baie sensitief, goedkoop en maklik om te gebruik. As gevolg van sy vermoë om aan enige dubbelstring DNA te bind, kan niespesifieke binding egter lei tot oorkwantifisering van PCR-produk.
Figuur 01: SYBR Groen Tegniek
Wat is Taqman?
Taqman is 'n alternatiewe metode vir SYBR Green om intydse PCR-proses te monitor. Hierdie metode hang af van die 5' - 3' eksonuklease aktiwiteit van Taq polimerase ensiem om die probes af te breek tydens die verlenging van die nuwe string en vrystelling van fluorofoor. Dubbel-gemerkte probes word in hierdie metode gebruik en dit is gebaseer op die hidrolise van probes. Probes is fluoresserend gemerkte DNA-oligonukleotiede met 'n fluoresserende verslaggewermolekule (fluorofoor) aan die 5'-punt en 'n blusmolekule aan die 3'-punt. Hulle is ontwerp om aan die enkelstrengige sjabloon aan die teenoorgestelde kant van die primer-gloei te bind. Taq-polimerase voeg nukleotiede by die primer en verleng die nuwe string na die dubbel-gemerkte probes. Sodra die Taq-polimerase die sonde ontmoet, aktiveer en degradeer die eksonuklease-aksie van die Taq-polimerase die sonde. Sodra dit die sintese van die nuwe string voltooi het, word die sonde aan volledige degradasie onderwerp en die fluorofoor vrygestel. Die vrystelling van fluorofoor genereer fluoressensie. Fluorescent Quencher-molekule doof die uitgestraalde lig doeltreffend en skep die uitset vir kwantifisering van die PCR-produk. Die vrystelling van fluorofore en hoeveelheid van die PCR-produkte is proporsioneel. Gevolglik kan kwantifisering maklik deur die Taqman-metode gedoen word.
Figuur 02: Taqman-metode
Taqman-metode word in intydse PCR gebruik, kwantifisering van geenuitdrukking, opsporing van genetiese polimorfismes, kwantifisering van chromosomale DNA-delesies, bakteriële identifikasie, verifikasie van mikroskikkingsanalise, SNP genotipering ens.
Wat is die verskil tussen SYBR-groen en Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Groen is gebaseer op DNA-bindende kleurstof. | Taqman is afhanklik van hibridisasie-probes en 5'- tot 3'-eksonuklease-aktiwiteit van Taq-polimerase. |
| Fluorescently labeled probes | |
| Geen fluorescent-gemerkte probes word nie vereis nie. | Dubbel-gemerkte probes word vereis. |
| Multiplekgeenanalise | |
| Dit kan nie vir multipleksgeen-teikens gebruik word nie. | Dit kan vir multipleksgeen-teikens gebruik word. |
| Koste | |
| Dit is goedkoper. | Dit is duurder. |
| Spesifisiteit | |
| Dit is minder spesifiek en bind met enige dubbelstring-DNA | Dit is baie spesifiek aangesien probes die spesifieke versterkingsprodukte opspoor. |
| Doeltreffendheid | |
| Dit is minder effektief. | Dit is hoogs effektief. |
| Aansoek | |
| Dit word gebruik in intydse PCR, agarosegelvisualisering, DNA-etikettering, ens. | Dit word gebruik in intydse PCR, kwantifisering van geenuitdrukking, opsporing van genetiese polimorfismes, ens. |
Opsomming – SYBR Green en Taqman
Taqman en SYBR-groen is twee metodes wat in intydse PCR (kwantitatiewe PCR) gebruik word. Beide metodes maak die kwantifisering van die PKR-produk doeltreffend moontlik en maak staat op die emissie van die fluoressensie. Taqman-metode gebruik dubbel-gemerkte probes vir opsporing van die opgehoopte DNA terwyl SYBR Green-metode 'n fluoresserende kleurstof gebruik. Beide hierdie metodes het ook verskillende toepassings in molekulêre biologie.
