Die sleutelverskil tussen konvensionele geneste en intydse PCR-toetse is dat konvensionele PCR 'n tegniek is wat ontwikkel is om spesifieke volgordes van DNA te amplifiseer en geneste PCR is 'n modifikasie van konvensionele PCR wat bestaan uit twee opeenvolgende amplifikasiereaksies, terwyl werklike -tyd PCR is 'n variant van konvensionele PCR wat in staat is om die versterkte produk te kwantifiseer.
PCR is 'n baie algemene wetenskaplike tegniek wat wyd in navorsing en medisyne gebruik word om DNS op te spoor. PCR-toetse word gebruik om antigene op te spoor deur hul DNA of RNA op te spoor. Oor die algemeen is virale RNA teenwoordig in die liggaam voordat teenliggaampies opgespoor word of die simptome van die siekte vertoon word.'n PCR-toets kan vroeg of iemand die virus het of nie. Tans is PCR die standaardtoets vir die opsporing van COVID-19-siekte. Daar is verskillende tipes PCR-tegnieke soos intydse PCR, geneste PCR, multipleks PCR, warmbegin PCR en langafstand PCR, ens.
Wat is konvensionele PCR-toetse?
Konvensionele PCR-toets is 'n in vitro DNA-amplifikasietegniek wat gereeld in molekulêre biologiese laboratoriums uitgevoer word. Hierdie metode het die vervaardiging van duisende tot miljoene kopieë van 'n spesifieke DNS-fragment moontlik gemaak. Kary Mullis het hierdie tegniek in 1980 bekendgestel. Hierdie tegniek vereis 'n DNS-fragment bekend as die sjabloon om baie kopieë daarvan te maak. Taq-polimerase werk as die DNA-polimerase-ensiem en kataliseer die sintese van nuwe stringe van die sjabloonvolgorde.
Primers in die PCR-mengsel sal as die beginpunte vir die fragment-uitbreidings werk. Al die bestanddele wat nodig is om kopieë van DNA te maak, word in die PCR-mengsel ingesluit. PCR-reaksie word in 'n PCR-masjien uitgevoer, en dit moet met die korrekte PCR-mengsel en die korrekte PCR-program gevoer word. As die reaksiemengsel en die program korrek is, sal dit die vereiste aantal kopieë van 'n spesifieke gedeelte van DNS uit 'n baie klein hoeveelheid DNS produseer.
Figuur 01: Konvensionele PCR-toets
Daar is drie hoofstappe betrokke by 'n PCR-reaksie: denaturering, primer-gloeiing en strengverlenging. Hierdie drie stappe vind plaas by drie verskillende temperature. PCR buffer handhaaf die optimale toestande vir die Taq polimerase aksie. Hierdie drie stadiums van PCR-reaksie word herhaal om die benodigde hoeveelheid van die PCR-produk te produseer. By elke PCR-reaksie verdubbel die aantal DNA-kopieë. Eksponensiële amplifikasie kan dus in PCR waargeneem word. PCR-produk kan opgelos word met behulp van gelelektroforese aangesien dit 'n sigbare hoeveelheid DNA op 'n jel produseer, en dit kan gesuiwer word vir verdere studies soos volgordebepaling.
PCR is 'n waardevolle hulpmiddel in mediese en biologiese navorsing. Veral in forensiese studies het PCR 'n geweldige waarde aangesien dit DNS kan versterk vir studies uit die klein monsters van die misdadigers en forensiese DNS-profiele kan maak. PCR word wyd gebruik in baie gebiede van molekulêre biologie, insluitend genotipering, geenkloning, mutasie-opsporing, DNA-volgordebepaling, DNA-mikroskikkings en vaderskaptoetsing.
Wat is geneste PCR-toetse?
Nested PCR is 'n tipe PCR wat die nie-spesifieke amplifikasie van DNA verminder. Daar is twee opeenvolgende PCR's of twee opeenvolgende amplifikasiereaksies in geneste PCR-toets. Tydens die eerste amplifikasiereaksie word 'n PCR-produk geproduseer. Na die eerste reaksie word 'n tweede amplifikasiereaksie op die PCR-produk van die eerste reaksie uitgevoer. Daarom bind primers in die tweede reaksiemengsel met die eerste PCR-produk en versterk dit.
Figuur 02: Geneste PCR
Primer-pare verskil in elke reaksie. Die nie-spesifieke binding van primers word verminder in geneste PCR. Geneste PCR-toetse is nuttig om die sensitiwiteit en/of spesifisiteit te verhoog. Geneste PCR vereis egter kennis oor die belangstellende volgorde.
Wat is intydse PCR-toetse?
Intydse PCR of kwantitatiewe PCR (Q PCR) is 'n gewysigde weergawe van PCR wat die PCR-produkte kwantitatief meet. Daarom kwantifiseer hierdie tegniek die versterking intyds met behulp van 'n intydse PCR-masjien. Dit is ook 'n geskikte metode om die hoeveelheid van 'n teikenvolgorde of geen teenwoordig in 'n monster te bepaal.
Die interessante kenmerk van intydse PCR is dat dit beide amplifikasie en ware kwantifisering in 'n enkele stap kombineer. Daarom kan die behoefte aan gelelektroforese vir opsporing uitgeskakel word deur die intydse PCR-tegniek. Die gebruik van fluoresserende kleurstowwe om PCR-produkte te merk tydens die PCR-reaksies sal uiteindelik lei tot direkte kwantifisering. Wanneer die PCR-produkte opgehoop word, word die fluoresserende seine ook opgehoop, en dit sal deur die intydse masjien gemeet word. SYBR Green en Taqman is twee metodes om die versterkingsproses van die intydse PCR op te spoor of te kyk. Albei metodes monitor die vordering van die versterkingsproses en rapporteer die hoeveelheid van die produk intyds.
Figuur 03: Real-Time PCR
Intydse PCR het 'n wye verskeidenheid toepassings soos geenuitdrukking kwantifisering, mikroRNA en nie-koderende RNA-analise, SNP genotipering, opsporing van kopiegetalvariante, opsporing van seldsame mutasies, opsporing van geneties gemodifiseerde organismes, en opsporing van aansteeklike middels.
Wat is die ooreenkomste tussen konvensionele geneste en intydse PCR-toetse?
- Geneste en intydse PCR-toetse is modifikasies van konvensionele PCR-toetse.
- Al drie tegnieke versterk DNA-monsters.
- Hulle produkte kan in volgordebepaling of ontleding gebruik word.
- Hierdie toetse vereis primers.
Wat is die verskil tussen konvensionele geneste en intydse PCR-toetse?
Konvensionele PCR is 'n tegniek wat ontwikkel is om spesifieke volgordes van DNA te versterk. Intussen is geneste PCR 'n modifikasie van konvensionele PCR wat uit twee opeenvolgende amplifikasiereaksies bestaan, en intydse PCR is 'n variant van konvensionele PCR wat in staat is om die geamplifiseerde produk te kwantifiseer. Dit is dus die belangrikste verskil tussen konvensionele geneste en intydse PCR-toetse. Anders as konvensionele en intydse PCR, gebruik geneste PCR twee primer-stelle. Boonop is daar twee opeenvolgende amplifikasiereaksies in geneste PCR om nie-spesifieke amplifikasie te verminder. buitendien bevat die konvensionele en intydse PCR-toetse nie twee opeenvolgende amplifikasiereaksies nie.
Die volgende infografika lys die verskille tussen konvensionele geneste en intydse PCR-toetse in tabelvorm vir vergelyking langs mekaar.
Opsomming – Konvensionele vs geneste vs intydse PCR-toetse
Konvensionele PCR is die eerste tegniek wat ontwikkel is om spesifieke fragmente van DNA te versterk. Geneste PCR en real-time PCR is twee variante van konvensionele PCR. Daar is twee opeenvolgende amplifikasiereaksies en die gebruik van twee primerstelle in geneste PCR. Intydse PCR is ontwikkel om die versterkte PCR-produk te kwantifiseer. Dus, dit som die verskil tussen konvensionele geneste en intydse PCR toetse op.
