Sleutelverskil – Genekloning vs PCR
Die sintese van baie kopieë van DNS vanaf 'n spesifieke DNS-fragment word DNS-amplifikasie genoem. Daar is twee hoof DNA-amplifikasieprosesse, naamlik geenkloning en PCR. Die belangrikste verskil tussen geenkloning en PCR is dat geenkloning die veelvuldige kopieë van 'n spesifieke geen in vivo produseer deur 'n rekombinante DNA te bou en binne 'n gasheerbakterie te groei, terwyl PCR miljoene kopieë van 'n spesifieke DNA-fragment in vitro produseer wat herhaalde siklusse van denaturering en sintese.
Wat is geenkloning?
Geenkloning is 'n tegniek wat gebruik word om 'n spesifieke geen op te spoor en te vermenigvuldig uit die onttrekte genomiese DNA van 'n organisme deur die konstruksie van rekombinante DNA. Genomiese DNA bevat duisende verskillende gene wat vir proteïene gekodeer is. Wanneer DNS onttrek word, sluit dit alle moontlike gene in wat dit kan dra. Geenkloningstegniek het die opsporing van 'n spesifieke geen uit die totale DNA moontlik gemaak. Daarom dien geenkloning as 'n belangrike hulpmiddel in molekulêre biologie.
Die maak van 'n genomiese biblioteek van 'n organisme is noodsaaklik in geenkloning as daar geen idee is oor die ligging van die betrokke geen in die DNA nie. 'n Genomiese biblioteek word gemaak deur die volgende stappe te gebruik.
Stap 1: Onttrekking van die totale DNA van 'n organisme wat die verlangde geen bevat.
Stap 2: Beperkingsvertering van die onttrekte DNA om klein hanteerbare fragmente te produseer. Hierdie stap word gefasiliteer deur beperking endonukleases.
Stap 3: Seleksie van 'n geskikte vektor en die oopmaak van die vektor-DNS met dieselfde beperking-endonukleases. Bakteriële plasmiede word algemeen gebruik as vektore om vreemde DNA te dra. Plasmiede is klein sirkels van DNA wat binne bakterieë geleë is.
Stap 4: Kombinasie van die vektor-DNS en gefragmenteerde DNA om rekombinante DNA-molekule te produseer. Hierdie stap word deur DNA-ligase beheer.
Stap 5: Oordrag van rekombinante DNA-molekules na gasheerbakterieë. Hierdie stap staan bekend as transformasie en word met 'n hitteskok gedoen.
Stap 5: Sifting van getransformeerde bakteriese selle op 'n kultuurmedium. 'n Gemengde populasie van getransformeerde en nie-getransformeerde gasheerselle word verkry aan die einde van die transformasieproses. As geen van belang sluit slegs in getransformeerde gasheerselle in. Daarom is dit nodig om getransformeerde selle te kies. Die keuse word gemaak met behulp van selektiewe media wat antibiotika bevat. Slegs die getransformeerde selle groei op hierdie siftingsmedium wat die seleksie moontlik maak.
Stap 6: Groei van bakterieë om 'n geenbiblioteek te produseer. In hierdie stap word die getransformeerde gasheerselle in vars kultuurmedia ingebring wat optimale groeivereistes voorsien. Totale kolonies op die kultuurplate verteenwoordig die genomiese biblioteek van daardie organisme.
Stap 7: Die rekombinante DNA-molekule wat die geen van belang bevat, moet van duisende gekloonde fragmente van rekombinante DNA gekeur word. Dit kan bewerkstellig word deur die gebruik van probes wat die spesifieke geen merk of die spesifieke proteïenresultate van daardie geen.
Sodra die belangstellende geen wat die bakteriese kolonie bevat uit die totale kolonies geïdentifiseer is, is dit moontlik om miljoene kopieë van die rekombinante plasmied wat die geen bevat, te maak.
Geenkloning word gebruik in die vestiging van geenbiblioteke, die vervaardiging van spesiale proteïene, vitamiene, antibiotika, hormone, volgordebepaling en kartering van genome van die organismes, die maak van veelvuldige kopieë van individue se DNA in forensiese ondersoeke, ens.
Figuur_1: Genekloning
Wat is PCR?
Polymerase kettingreaksie (PCR) is 'n tegniek wat 'n groot aantal kopieë van 'n spesifieke DNS-fragment genereer. Eksponensiële amplifikasie van 'n spesifieke DNS-volgorde word verkry deur PCR onder in vitro toestande. Hierdie tegniek is 'n baie kragtige hulpmiddel in Molekulêre Biologie, aangesien dit 'n klein monster DNA in 'n bruikbare hoeveelheid kan vermenigvuldig. PCR is in 1983 deur Kary Mullis bekendgestel en hierdie bekroonde uitvinding het 'n groot vooruitgang in Molekulêre Biologie geskep.
PCR-tegniek volg herhaalde PKR-reaksies soos in Figuur 02 getoon. Een PKR-reaksie bestaan uit drie hoofstappe wat by drie verskillende temperature plaasvind; denaturering van dubbelstrengs by DNA by 94 0C, uitgloeiing van primers by 68 0C en string verlenging by 72 0 C. Daarom, wanneer PCR uitgevoer word, moet temperatuurskommeling hoogs gehandhaaf word vir behoorlike replikasie. PCR word uitgevoer in 'n PCR-masjien binne PCR-buise. PCR-buise word gelaai met korrekte PCR-mengsels wat templaat-DNA, Taq-polimerase, primers, dNTP's en buffer bevat. Denaturering van dubbelstrengs monster DNA in enkelstrengs DNA word gedoen deur die waterstofbindings tussen komplementêre basisse te breek by 94 – 98 0C. Dan word enkele stringe sjabloon-DNA vir primers blootgestel. 'n Paar onderlaag (vorentoe en agtertoe) moet voorsien word, en hulle moet termostabiel wees om hoë temperature te verdra. Primers is enkelstrengige kort DNS-volgordes wat komplementêr is tot die punte van die teiken DNS-fragment. Sintetiese primers word in PCR gebruik. Primers bind met die komplementêre basisse van monster DNA en begin die sintese van 'n nuwe string. Hierdie stap word gekataliseer deur 'n ensiem genaamd Taq-polimerase; 'n termostabiele DNA-polimerase-ensiem wat uit Thermus auqaticus geïsoleer is. Wanneer primers en nukleotiede (boublokke) beskikbaar is, konstrueer Taq-polimerase die nuwe DNA-string komplementêr tot templaat-DNA. Aan die einde van die PKR-program word geamplifiseerde DNA-fragment waargeneem met behulp van gelelektroforese. Indien verdere ontleding benodig word, word PCR-produk van die jel gesuiwer.
PCR is baie nuttig vir die diagnose en monitering van genetiese en verworwe siektes, identifisering van misdadigers (in die veld van forensiese), die bestudering van die struktuur en funksie van 'n geteikende segment van DNS, volgordebepaling en kartering van genome van organismes, ens. PCR het 'n roetine-laboratoriumtegniek in mediese en molekulêre biologie-navorsingslaboratoriums onder wetenskaplikes geword, aangesien dit 'n wye verskeidenheid toepassings het.
Figuur_2: Polimerase-kettingreaksie
Wat is die verskil tussen geenkloning en PCR?
Geenkloning teen PCR |
|
| Geenkloning is die proses om veelvuldige kopieë van 'n spesifieke geen in vivo deur rekombinante DNA te maak en in 'n gasheerbakterie te transformeer. | Die PCR-tegniek produseer veelvuldige kopieë van 'n spesifieke DNS-volgorde in vitro deur herhaalde siklusse van PCR-reaksies. |
| Vereiste vir die konstruksie van rekombinante DNA | |
| Rekombinante DNA word geproduseer om die geen op te spoor. | Rekombinante DNA word nie geproduseer nie. |
| Need of Labour | |
| Hierdie proses is arbeidsintensief. | Intensiewe arbeid is nie nodig nie. |
| In vivo of In vitro proses | |
| Konstruksie van rekombinante DNA is in vitro en die amplifikasie van DNA is in vivo. | Die amplifikasie van DNA vind heeltemal in vitro plaas. |
Opsomming – Geenkloning vs PCR
Geenkloning en PCR is twee metodes wat vir DNA-amplifikasie gebruik word. PCR is 'n in vitro proses wat veelvuldige kopieë van DNS van 'n spesifieke DNS-fragment maak sonder om rekombinante DNS en 'n gasheerorganisme te gebruik. Geenkloning is hoofsaaklik 'n in vivo proses wat lei tot veelvuldige kopieë van 'n geïnteresseerde geen binne die gasheerorganisme via konstruksie van rekombinante DNA. Dit is die verskil tussen geenkloning en PCR.
