Sleutelverskil – RT PCR vs QPCR
Polymerase-kettingreaksie is 'n tegniek wat gebruik word om 'n spesifieke DNS-gebied in vitro te versterk. As gevolg van die uitvinding van hierdie tegniek deur Kary Mullis in 1983, is wetenskaplikes in staat om duisende tot miljoene kopieë van spesifieke DNS-fragmente vir navorsingsdoeleindes te maak. Tans het dit 'n algemene tegniek geword wat gereeld uitgevoer word in kliniese en navorsingslaboratoriums vir 'n wye verskeidenheid toepassings. Daar is variasies van tradisionele PCR-tegniek soos RT PCR, geneste PCR, multipleks PCR, Q PCR, RT – QPCR, ens. RT PCR en Q PCR is twee belangrike variasies van PCR. Die belangrikste verskil tussen RT PCR en Q PCR is dat RT PCR gebruik word om geenuitdrukking op te spoor deur die skepping van komplementêre DNA (cDNA) transkripsies vanaf RNA terwyl Q PCR gebruik word om die PCR produkte intyds kwantitatief te meet deur gebruik te maak van fluoresserende kleurstowwe.
Wat is RT PCR?
Omgekeerde transkripsie polimerase kettingreaksie (RT PCR) is 'n variant van PCR wat gebruik word om RNA uitdrukking op te spoor. Dit is 'n baie belangrike metode om mRNA-uitdrukking in weefsels op te spoor. RT PCR word gebruik wanneer die beginmateriaal van die monster RNA is. In RT PCR word die templaat-mRNA eers in komplementêre DNA omgeskakel. Hierdie stap word deur die ensiem omgekeerde transkripsie gekataliseer en die proses staan bekend as omgekeerde transkripsie. Tweedens word tradisionele PCR gebruik vir die nuut gesintetiseerde cDNA vir die amplifikasie.
RT PCR is 'n hoogs sensitiewe tegniek wat 'n relatief klein hoeveelheid RNA-monster vereis. RT PCR word algemeen gebruik in die diagnose en kwantifisering van RNA-spesies, veral RNA-virusse soos menslike immuniteitsgebreksvirus en hepatitis C-virus.
Figuur 01: RT PCR-tegniek
Wat is QPCR?
Kwantitatiewe PCR (QPCR) is 'n variant van PCR wat gebruik word om die PCR-produkte kwantitatief te meet. Dit word ook na verwys as intydse polimerase kettingreaksie aangesien dit die versterking van intydse meet met behulp van intydse PCR-masjien. Dit is 'n geskikte metode om die hoeveelheid van 'n teikenvolgorde of geen in 'n monster te bepaal. Die interessante kenmerk van QPCR is dat dit beide amplifikasie en ware kwantifisering in 'n enkele stap kombineer. Daarom kan die behoefte aan gelelektroforese in opsporing uitgeskakel word deur QPCR-tegniek. QPCR gebruik fluoresserende kleurstowwe om PCR produkte te merk tydens die PCR reaksies wat uiteindelik lei tot direkte kwantifisering. Wanneer die PCR-produkte ophoop, word die fluoresserende seine ook opgehoop en dit sal deur die intydse masjien gemeet word. QPCR kan gekombineer word met RT PCR. Dit staan bekend as RT – QPCR of QRT – PCR en word beskou as 'n mees kragtige, sensitiewe en kwantitatiewe metode vir die opsporing van RNA-vlakke in die selle of weefsels.
SYBR Green en Taqman is twee metodes wat gebruik word om die versterkingsproses van die intydse PCR op te spoor of te kyk. SYBR Groen-metode word uitgevoer met behulp van 'n fluoresserende kleurstof genaamd SYBR-groen en bespeur die versterking deur die kleurstof te bind om dubbelstrengs DNA te produseer. Taqman word uitgevoer met behulp van dubbel-gemerkte probes en bespeur die amplifikasie deur degradasie van die sonde deur Taq polimerase en vrystellings van die fluorofoor soos getoon in figuur 02. Beide metodes monitor die vordering van die amplifikasie proses en rapporteer die hoeveelheid van die produk intyds.
Intydse PCR het 'n wye verskeidenheid toepassings soos geenuitdrukking-kwantifisering, mikroRNA en niekoderende RNA-analise, SNP genotipering, opsporing van kopiegetalvariante, opsporing van seldsame mutasies, opsporing van geneties gemodifiseerde organismes, opsporing van aansteeklike middels, ens.
Figuur 02: Kwantitatiewe PCR-tegniek
Wat is die verskil tussen RT PCR en QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR is 'n tegniek wat gebruik word om geenuitdrukking deur amplifikasie op te spoor. | QPCR is 'n tegniek wat DNS versterk en die PCR-produkte intyds kwantifiseer. |
| Betrokkenheid van omgekeerde transkripsie-ensiem | |
| Ensiem-omgekeerde transkripsie word gebruik vir RT PCR. | Ensiem-omgekeerde transkripsie word nie vir QPCR gebruik nie. |
| Gebruik van fluoresserend gemerkte molekules | |
| Fluorescently gemerkte kleurstowwe of probes word nie vir RT PCR gebruik nie. | Fluorescently gemerkte kleurstowwe of probes word vir QPCR gebruik. |
| Kwantifisering van PCR-produk | |
| Tensy gekoppel aan QPCR, kwantifiseer RT PCR nie die PCR-produk nie. | QPCR meet die PCR-produk kwantitatief. |
| Beginmateriaal | |
| Beginmateriaal is mRNA. | Beginmateriaal is DNA. |
| Sintese van cDNA | |
| Komplimentêre DNA word tydens die RT PCR geproduseer. | Komplimentêre DNA word nie tydens QPCR geproduseer nie. |
Opsomming – RT PCR vs QPCR
RT PCR en QPCR is twee weergawes van tradisionele PCR. RT PCR-tegniek word vir mRNA-monsters uitgevoer en dit word aangedryf deur omgekeerde transkripsie en produksie van cDNA. QPCR word gebruik om PCR-produkte te kwantifiseer tydens die intydse PCR-termiese siklusse deur gebruik te maak van fluoresserende kleurstowwe of gemerkte probes. In QPCR word die hoeveelheid PCR-produk voorgestel deur die uitgestraalde fluoresserende seine deur die monster. RT PCR word algemeen gebruik as 'n amplifikasieproses terwyl QPCR algemeen as 'n kwantifiseringsproses gebruik word. Dit is die verskil tussen RT PCR en QPCR.
